16ème Fiches:
Le bêta-caryophyllène est un cannabinoïde alimentaires
Jürg Gertsch, * † Marco Leonti, ‡ § Raduner Stefan, * § Ildiko Racz, ¶ -Zhong Chen Jian, ‖ -Qun Xie Xiang, ‖ -Heinz Karl Altmann, * Meliha Karsak, ¶ et Andreas Zimmer ¶
* Institut des sciences pharmaceutiques, Département de chimie et sciences biologiques appliquées, Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) de Zurich, 8092 Zurich, Suisse;
‡ Dipartimento Farmaco Chimico Tecnologico, Université de Cagliari, 01924 Cagliari, Italie;
¶ Département de psychiatrie moléculaire, Université de Bonn, 53115 Bonn, Allemagne, et
‖ Département des sciences pharmaceutiques, Université de Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15260
† A qui la correspondance doit être adressée. E-mail: juerg.gertsch pharma.ethz.ch @
Editée par LL Iversen, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni, et a approuvé le 6 mai 2008
Soumis par
contributions Auteur: JG et MK conçus de recherche; JG, ML, SR, IR, et J.-ZC effectué des recherches; AZ contribué nouveaux réactifs / outils d'analyse; JG, X.-QX, K.-HA, MK, et AZ analysé données, et JG a écrit le papier.
§ ML et SR ont contribué également à ce travail.
RÉSUMÉ
Les cannabinoïdes psychoactifs du Cannabis sativa L. et le dérivé d'acide arachidonique endocannabinoïdes sont non sélectifs ligands naturels pour récepteur cannabinoïde de type 1 (CB 1 ) et CB 2 récepteurs. Bien que le CB 1 récepteur est responsable des effets psychomodulatory, l'activation de la CB 2 récepteur est une stratégie thérapeutique potentielle pour le traitement de l'inflammation, la douleur, l'athérosclérose et l'ostéoporose. Ici, nous déclarons que la plante répandue volatile ( E )-β-caryophyllène [( E )-BCP] se lie sélectivement à la CB 2 récepteurs ( K i = 155 ± 4 nm) et qu'il s'agit d'une fonctionnelle CB 2 agoniste. Curieusement, ( E )-PCA est un constituant commun des huiles essentielles d'épices et de nombreuses plantes alimentaires et un élément majeur de cannabis . simulations d'amarrage moléculaire ont identifié un site de liaison putatif de ( E )-BCP dans le CB 2 récepteurs, montrant ligand π-π interactions d'empilement de résidus F117 et W258. Lors de la liaison à l'OC 2 récepteurs, ( E )-BCP inhibe cylcase cyclase, conduit à des transitoires de calcium intracellulaire et active faiblement le-kinases activées par un mitogène ERK1 / 2 et p38 dans les écoles primaires de monocytes humains. ( E )-BCP (500 nM) inhibe le lipopolysaccharide (LPS)-pro-inflammatoires induit l'expression des cytokines dans le sang périphérique et atténue LPS-stimulé ERK1 / 2 et JNK1 / 2 phosphorylation dans les monocytes. En outre, par voie orale ( E )-BCP à 5 mg / kg fortement réduit la réponse inflammatoire induite par la carragénine dans de type souris sauvages mais pas chez les souris dépourvues CB 2 récepteurs, ce qui prouve que ce produit naturel exerce des effets cannabimimétiques in vivo . Ces résultats mettent en évidence ( E )-BCP en tant que fonctionnelle nonpsychoactive CB 2 ligand du récepteur dans la denrée alimentaire et comme un anti-inflammatoire des cannabinoïdes macrocycliques dans Cannabis .
Mots-clés: Cannabis , récepteur cannabinoïde CB2, denrée alimentaire, l'inflammation, produit naturel
huiles essentielles des plantes sont typiquement composés volatils de terpènes aromatiques et phénylpropanoïdes. Ces volatiles lipophile librement traverser les membranes cellulaires et servir différents rôles écologiques, comme les insectes interactions plantes ( 1 , 2 ). Le sesquiterpène ( E )-β-caryophyllène [( E )-BCP] ( Fig 1. ) est une importante usine volatile trouve en grande quantité dans les huiles essentielles d'épices différentes et de nombreuses plantes alimentaires, comme l'origan ( Origanum vulgare L. ), la cannelle ( Cinnamomum spp (.) noir et le poivre Piper nigrum L.) ( 3 - 5 ). Dans la nature, ( E )-BCP se trouve généralement avec de petites quantités de ses isomères ( Z )-β-caryophyllène [( Z )-BCP ou isocaryophyllene] et α-humulène (anciennement α-caryophyllène) ou dans un mélange avec ses produit d'oxydation, l'oxyde de BCP ( Fig 1. ). En raison de son goût aromatique faible, ( E )-BCP est commercialement utilisé comme un additif alimentaire et dans les cosmétiques ( 6 ). ( E )-BCP est également une composante importante (jusqu'à 35%) dans l'huile essentielle de Cannabis sativa L ( 7 ). Bien que le cannabis contient> 400 différents métabolites secondaires, y compris plus de 65 cannabinoïdes comme des produits naturels, que Δ 9 -tétrahydrocannabinol (THC), Δ 8 -tétrahydrocannabinol, le cannabinol et ont été rapportés pour activer types récepteur cannabinoïde 1 (CB 1 ) et 2 ( CB 2 ) ( 8 ). Ici, nous montrons que le composant d'huile essentielle ( E )-BCP se lie sélectivement à la CP55, 940 sites de liaison (c.-à-THC site de liaison) dans le CB 2 récepteurs, conduisant à l'activation cellulaire et des effets anti-inflammatoires.
Fig. 1.
Caryophyllane-et-type sesquiterpènes humulane dans C. sativa et de nombreuses autres plantes. La carte montre les structures chimiques des sesquiterpènes bicycliques ( E )-β-caryophyllène, ( Z )-β-caryophyllène, l'oxyde de caryophyllène, et le cycle ouvert (plus ...)
CB 1 et CB 2 récepteurs cannabinoïdes sont GTP-binding protein (protéine G) récepteurs couplés qui ont d'abord été cloné dans le début des années 1990 ( 9 , 10 ). Bien que le CB 1 récepteur est exprimé dans le système nerveux central et dans la périphérie, les CB 2 récepteur se trouve surtout dans les tissus périphériques ( 11 ). In vivo , les récepteurs sont activés par CB arachidonique dérivés de l'acide endocannabinoïdes, comme le 2-arachidonoyl éthanolamine (anandamide ou AEA) et le 2-arachidonoylglycérol (2-AG) ( 12 , 13 ). En plus d'un large éventail d'abord CB 1 médiée par le récepteur des effets physiologiques sur le système nerveux central, différents ligands cannabinoïdes ont été signalés à moduler la réponse immunitaire ( 14 ). En particulier, CB 2 ligands de récepteurs ont été capables d'inhiber l'inflammation et la formation d'oedème ( 15 ), présentent des effets analgésiques ( 16 ), et jouer un rôle protecteur dans les lésions d'ischémie-reperfusion hépatique ( 17 ). Dans le tractus gastro-intestinal, CB 2 agonistes des récepteurs ont été montré pour empêcher la colite expérimentale en réduisant l'inflammation ( 18 ). En outre, l'OC 2 récepteur a été décrite comme une cible potentielle pour le traitement de l'athérosclérose ( 19 ) et l'ostéoporose ( 20 ). Par conséquent, CB 2 -agonistes sélectifs des récepteurs qui sont dépourvus des effets secondaires psychoactifs généralement associées aux CB 1 activation du récepteur sont candidats médicaments potentiels pour le traitement d'une gamme de différentes maladies.
RÉSULTATS
Identification de la BC 2 -ligands sélectifs du récepteur de cannabis Huile Essentielle.
Dans notre recherche permanente de nouveaux CB 2 cannabinoïdes ligands sélectifs du récepteur à partir de sources naturelles, nous avons constaté que C. sativa huile essentielle (5 ug / ml) sans les cannabinoïdes classique fortement déplacé la haute affinité radioligand [ 3 H] CP55, 940 ( 21 ) à partir de h CB 2 , mais non h CB 1 récepteurs [ renseignements à l'appui (SI) Fig. S1 ]. La même observation a été faite pour un certain nombre d'autres huiles essentielles, ce qui suggère que le cannabis peut contenir des huiles essentielles CB deux composés actifs des récepteurs autres que les cannabinoïdes classique et que ces ligands peuvent également surviennent fréquemment chez les autres espèces végétales. Le fractionnement de cannabis huile essentielle par chromatographie sur colonne et le dépistage des constituants isolés donné ( E )-BCP en tant que CB 2 contraignant composé récepteur ( Fig 1. ).
Quantitatives radioligand expériences de liaison ont montré que ( E )-PCA et de son isomère, ( Z )-BCP ( Fig 1. ), dose-dépendante déplacées [ 3 H] CP55, 940 de h CB 2 récepteurs exprimés dans les cellules HEK293 avec une apparente K i valeurs dans l'intervalle nM ( Fig 2. A ). ( E )-BCP, qui est l'isomère retrouve principalement dans les plantes, ont montré une légère augmentation de CB 2 contraignant affinité pour le récepteur ( K i = 155 ± 4 nm) que ( Z )-BCP ( K i = 485 ± 36 nM). Notamment, l'oxyde de BCP ( Fig 1. ), qui est le produit d'oxydation BCP volatils détectée par les chiens de détection de stupéfiants ( 22 ), et le cycle ouvert isomère α-humulène n'a pas remplacé [ 3 H] CP55, 940 de l' h CB 2 récepteur ( K i > 20 M) ( Fig. S2 ). En conformité avec les données obtenues avec le cannabis huiles essentielles ( Fig. S1 ), isomères BCP n'a pas montré une affinité de liaison importante pour les h CB 1 récepteur ( Fig. S2 ). En outre, aucun des autres grands Cannabis terpènes (10 uM) a montré un déplacement significatif de la [ 3 H] CP55, 940 (> 50%) dans les deux h CB 2 ou h CB 1 récepteur radioligand analyses de liaison ( Fig. S2 ).
Fig. 2.
( E )-BCP et ( Z )-BCP déplacer le [ 3 H] CP-55, 940 de h CB 2 récepteurs exprimés dans les cellules HEK293. ( A ) courbes sigmoïdes (R 2 = 0,93 pour ( E )-BCP et 0,98 pour les ( Z )-BCP) présentent un déplacement d'ensemble (71% et 84%, respectivement) avec K i des valeurs de 155 et 485 (plus .. .)
(E)-BCP Lié de façon concurrentielle à l' h CB 2 Receptor Binding Site THC.
Les études de liaison des récepteurs ont été entravées par la mauvaise solubilité dans l'eau de la apolaire ( E )-BCP (ClogP = 6,7). ( E )-BCP a conduit à la formation de gouttelettes d'huile à des concentrations> 1 M, alors que ( Z )-BCP ont montré une solubilité dans l'eau un peu mieux (données non présentées). En conséquence, la courbe de déplacement ( E )-BCP a montré une tendance biphasique et K i pour les valeurs ( E )-BCP et ( Z )-BCP calculé à partir du tracé de Hill ont été 780 ± 12 nM et 974 ± 65 nM, respectivement ( figure 2. B ). Ainsi, le K i pour les valeurs ( E )-BCP obtenus dans la régression non linéaire ( Fig 2. A ), et le tracé de Hill ( Fig 2. B ) a montré une importante 5-fold différence statistiquement. Parce que le tracé de Hill pour ( E -BCP s'écarte) de la linéarité, la possibilité d'une nature biphasique du déplacement a été explorée à l'aide du logiciel Prism GraphPad. La courbe de déplacement biphasique a montré une faible corrélation ( R 2 <0,8), ce qui suggère que la solubilité plutôt que la présence de multiples sites de liaison a été responsable de l'écart entre K i les valeurs des analyses de régression non linéaire et les parcelles Hill. Cela a été confirmé par une analyse de Dixon dans lequel la liaison compétitive du ( E )-BCP à la CP55, 940 sites de liaison a été montré ( Fig 2. C ). La constante d'inhibition estimée à partir de la parcelle a été Dixon ≈ 500 nM, ce qui confirme encore la gamme nanomolaire de l'( E -BCP affinité de liaison). Parce que le THC et CP55, 940 parts de la liaison dans le même site h CB 2 récepteurs, on peut conclure que ( E )-BCP THC se lie à la poche de liaison ou d'un site qui se chevauchent.
In Silico Docking analyse des E)-BCP CB ( 2 reliure interaction avec le récepteur.
Computational analyses d'accueil, l'aide-Dock calculs Surflex (voir SI Matériaux et méthodes ) avec une place CB 2 homologie modèle de récepteur ( 23 ), suggèrent que ( E ) BCP-lie dans la région hydrophobe de la cavité de l'eau accessible. Le ( E )-BCP-CB 2 énergétiques complexes a été minimisé par MD / simulations MM. Le site de liaison putatif de CB 2 ligands du récepteur est adjacent à hélices III, V, VI, VII et à la extracellulaire site proche de la 7TM faisceaux ( Fig 3. ). Dans ce modèle, le lipophile ( E )-BCP quais dans la cavité hydrophobe de la liaison poche amphiphatique et le mode de liaison de ( E )-BCP semble être facilitée par π-π interactions d'empilement de résidus F117 (4,0 Å) et W258 (4,6 Å). En outre, ( E )-BCP interagit étroitement avec les résidus hydrophobes I198, V113 et M265 ( Fig 3. ). Seuls quatre géométries différentes sont permis dans ( E )-BCP, en raison des contraintes imposées par les chaînons neuf. Ces conformations sont désignés αα, αβ, βα, et ββ, montrant les orientations relatives des-C13 double liaison exocyclique C8 et de la C4-C5 (-C12) groupement vinylique, dans laquelle α ou β désigne la position de la C8- C13 double liaison et le méthyle C12 ci-dessous ou au-dessus du plan de la molécule ( 24 ). Sur la base des données obtenues par modélisation moléculaire, la conformation bioactive de ( E )-BCP dans le CB 2 complexe récepteur ressemble à l'énergie conformère faible ββ ( 24 ). Parce que le Dock-scores sont exprimés en Surflex-log ( K d ) les unités, les résultats de la modélisation indiquent aussi que ( E )-BCP (-log ( K d ) = 7,86) et ( Z )-BCP (7,96) présentent> 1000 fois plus élevée CB 2 contraignant affinité pour certains récepteurs de α-humulène (4,17), qui est en accord avec les données expérimentales montre la Fig. S2 .
Fig. 3.
Modèle de l'interaction putative de ( E )-BCP avec le CB 2 récepteurs déterminée par Surflex-Dock et MD / calculs MM. ( E )-BCP se trouve dans la région hydrophobe de la amphipathique CB 2 récepteurs poche de liaison où il interagit étroitement avec hydrophobe (plus ...)
( E )-BCP est une CB complet 2 agoniste des récepteurs conduisant à G i et G o signaux.
Nous avons ensuite déterminé si l'interaction entre ( E )-BCP avec le CB 2 récepteur conduit à la mobilisation des protéines G. Comme le puissant de haute affinité ligand cannabinoïde WIN55 ,212-2 ( K i h CB 2 = 1,2 nM) ( 21 ), ( E )-BCP inhibé la forskoline stimulée par l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans la production h CB 2 récepteurs CHO transfectées K1-cellules ( Fig 4. A ). La différence de puissance entre WIN55 ,212-2 (CE 50 = 38 ± 5,7 nM) et ( E )-BCP (CE 50 = 1,9 ± 0,3 uM) ( Fig 4. A ) reflète la différence de 150 fois en CB ≈ 2 liaison affinité pour le récepteur entre ces ligands. Afin de déterminer si ( E )-PCA est un agoniste fonctionnel entièrement à la CB 2 récepteurs, nous avons mesuré CB 2 médiée par les transitoires du calcium intracellulaire ([Ca 2 + ] i ) dans les cellules HL60 promyelotic. Comme l'endocannabinoïde 2-arachidonoylglycérol (2-AG), qui est un puissant activateur de la G o voie qui mène à la [Ca 2 + ] i de libération ( 25 ), également ( E )-BCP concentration-dépendante déclenché la libération de [ Ca 2 + ] i ( Fig 4. B ). L'augmentation maximale de [Ca 2 + ] i de ( E )-PCA ( E max = 312 ± 41%) a été un peu plus faible que l'effet maximal obtenu avec le 2-AG ( E max = 409 ± 17%) ( figure 4. B ). Toutefois, l' E max et CE 50 valeurs obtenues dans les analyses de régression non linéaire ne sont pas statistiquement différents pour le 2-AG (CE 50 = 13,8 ± 0,9 pM) et E -BCP (CE 50 = 11,5 ± 2,8 pM). Dans les cellules HL60 dépourvues de CB 2 récepteur de surface expression E -BCP n'a pas déclenché [Ca 2 + ] i ( Fig 4. C ). En outre, la [Ca 2 + ] i induite par les transitoires ( E )-BCP et le 2-AG ont été complètement bloquée par le CB 2 SR144528 antagoniste du récepteur, qui supporte une stricte CB 2 dépendant du récepteur G o mécanisme de [Ca 2 + ] i libération par ( E )-BCP ( Fig 4. D ). oxyde de BCP induite importante [Ca 2 + ] i transitoires en CB 2 positifs, mais induit encore plus fortement en CB 2 cellules HL60 déficients ( figure S3. A ), suggérant une CB 2 -mécanisme indépendant du récepteur de l'action. Comme prévu, cet effet n'a pas pu être inhibée par SR144528 ( Fig. S3 B ). Parce que CB 2 -agonistes sélectifs du récepteur ont été montré pour augmenter la phosphorylation de-activated protein mitogène (MAP) kinases p38 ( 26 ) et extracellulaire du récepteur kinases 1 / 2 (ERK1 / 2) ( 27 ), nous avons incubé les CB 2 récepteur sélectif JWH133 agoniste ( K i = 3,4 nM) et ( E )-BCP avec des cellules HL60 et primaires humaines CD14 + monocytes pour déterminer la phosphorylation de ces kinases sur CB 2 l'activation du récepteur. ( E )-BCP et JWH133 (1 mM) a conduit à la phosphorylation rapide de ERK1 / 2 dans les deux HL60 et primaire CD14 + monocytes, et cet effet pourrait être bloquée par incubation préalable avec le CB 2 SR144528 antagoniste du récepteur ( Fig. S4 ). Bien que ( E )-BCP faiblement augmenté phosphorylée p38 dans les cellules HL60 et CD14 à la fois primaire + monocytes, JWH133 n'a pas déclenché p38 phosphorylation de CD14 primaire + monocytes.
Fig. 4.
protéines G déclenché des effets ( E )-BCP sur CB 2 de liaison au récepteur. ( A ) La haute affinité ligand CB WIN55 ,212-2 et ( E )-BCP dose-dépendante inhiber la forskoline a stimulé la production d'AMPc dans CB 2 récepteurs transfectées-K1 cellules CHO. Les données sont des valeurs moyennes (plus ...)
( E )-BCP Inhibe lipopolysaccharide (LPS)-TNF α-1β et d'IL-Expression stimulée dans le sang périphérique.
CB 2 agonistes des récepteurs ont été maintes fois démontré qu'il inhibe la libération de cytokines par des monocytes stimulés par LPS, comme facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) ( 14 , 28 , 29 ). Pour déterminer si ( E )-BCP déclenche CB 2 -dépendante des effets sur le récepteur de l'expression des cytokines in vitro , nous avons mesuré les niveaux de cytokine dans LPS stimulée par le sang total humain après 18 h en présence et en absence de ( E )-BCP. À 500 nm, ( E )-BCP significativement inhibée LPS-stimulés-1β et TNF-α expression de l'IL ( Fig 5. A ). Cette inhibition est clairement infirmée par la CB 2 antagoniste sélectif des récepteurs AM630 (5 uM), indiquant ainsi une fonctionnelle CB 2 -dépendante mécanisme récepteur. AM630 a été utilisé parce SR144528 inhibe fortement l'expression des cytokines dans le sang total, comme indiqué dans la réf. 29 . Comme le montre la Fig. 5 A , l'effet anti-inflammatoire a été moins prononcé avec des concentrations croissantes de ( E )-BCP, ce qui reflète probablement la formation de ( E -BCP agrégats) ou une faible cellulaires stimulation simultanée de cytokines par une faible affinité pour cible à des concentrations pM. Inférieure à 500 nm, l'inhibition de cytokines a été la concentration proportionnelle, et ( E )-BCP ont produit moins d'inhibition (données non présentées). Le LPS-niveaux d'expression stimulée de l'IL-6, -8 et -10 n'ont pas été significativement influencé par ( E )-BCP après 18 h ( Fig. S5 ).
Fig. 5.
Les effets anti-inflammatoires de ( E )-BCP in vitro et in vivo . ( A ) ( E )-BCP (1 h d'incubation avant la stimulation) inhibe LPS-stimulés (313 ng / ml) 1β et TNF-α expression de la protéine IL-dans le sang humain total périphérique (déterminée après 18 h). (plus .. .)
( E )-BCP Inhibe Lipopolysaccharide-ERK1 / 2 stimulée et JNK1 / 2 d'activation des monocytes primaires.
Partant du constat que ( E )-BCP faiblement induit p38 et Erk1 / 2 phosphorylation dans les écoles primaires CD14 + et les monocytes, dans le même temps, inhibe LPS-TNF-α stimulée et IL1β expression de la protéine dans le sang total, nous avons examiné si LPS- déclenché p38, Erk1 / 2, et JNK1 / 2 a été modulée par l'activation ( E )-BCP. stimulation par le LPS de l'enseignement primaire monocytes humains a conduit à une forte et rapide de la phosphorylation de p38 et JNK1 / 2, alors qu'une plus faible activation de ERK1 / 2 a été détectée. L'incubation des cellules avec ( E )-BCP (500 nM) pendant 1 h avant la stimulation LPS conduit à une réduction significative de ERK1 / 2 et JNK1 / 2 activation (phosphorylation) tel que déterminé par Western blot ( Fig. S6 A ) et le talon cytometic array (ABC) analyses ( Fig. S6 B ), alors que p38 activation n'a pas été influencée par ( E )-BCP (données non présentées).
Oral ( E )-BCP Inhibe carraghénane-oedème induit chez les souris de type sauvage.
Pour obtenir in vivo des preuves des effets anti-inflammatoires induite par ( E )-BCP in vitro , nous avons examiné l'efficacité de l'administré par voie orale ( E )-PCA de type souris sauvages (CNR2 + / + ) et CB 2 récepteur déficient (CNR2 - / - ) la souris. ( E )-BCP (5 et 10 mg / kg) administré par voie orale a significativement inhibé provoqué par la carragénine œdème de la patte de type souris sauvages par ≈ 70% et 50%, respectivement ( figure 5. B ). Plutôt inattendue, la plus faible dose de ( E )-BCP a été plus efficace dans cette expérience ( Fig 5. B ). Parce que pas d'effet anti-inflammatoire a pu être observée avec les deux doses les plus faibles de ( E )-PCA CNR2 - / - souris, les effets anti-inflammatoires de ( E )-PCA de type souris sauvages montrent que ce produit naturel exerce CB 2 dépendant du récepteur cannabimimétiques effets in vivo . En outre, 10 mg / kg ( E )-BCP ont montré une biphasique effet intéressant, tels que la formation d'oedème a été augmentée au bout de 30 min par rapport à la maîtrise du véhicule, mais clairement inhibée après 120 min. Cela n'a pas été observée dans CNR2 - / - souris, démontrant ainsi que le CB 2 récepteur est impliqué dans les deux effets. Parce que 50 mg / kg ( E )-BCP n'a montré qu'une faible activité anti-inflammatoire dans les deux de type sauvage et CNR2 - / - souris ( . Fig 5 B ), des doses plus élevées de ( E )-BCP peut conduire à l'objectif effets hors. En comparaison, le CB 2 agoniste sélectif des récepteurs JWH133 ( K i = 3,4 nM) était significativement moins efficace dans l'inhibition induite par la carragénine la formation d'oedème de ( E )-BCP après administration orale ( Fig 5. C ) malgré ses 45 fois plus élevée CB 2 affinité pour les récepteurs.
( E )-BCP contenu dans le cannabis Essential Oil corrélats avec CB 2 activation du récepteur.
( E )-BCP contenu est connue pour varier dans Cannabis souches et préparations ( 7 ), et nous avons donc analysé cinq commerciale Cannabis huiles essentielles manquent cannabinoïdes classique par chromatographie en phase gazeuse quantitative (GC). Le pourcentage de ( E )-BCP dans les huiles essentielles a varié entre 12,5 et 35% ( Fig. S7 ). Le ( E )-BCP contenu dans le cannabis huiles essentielles en corrélation positive avec le déplacement de [ 3 H] CP55, 940 et le montant de [Ca 2 + ] i déclenchée par CB 2 récepteurs dans les cellules HL60 ( Fig. S7 ), confirmant ainsi que ce produit naturel est le seul cannabimimétiques de cannabis huile essentielle.
DISCUSSION
La végétation abondante sesquiterpène ( E )-BCP est représentée de manière compétitive interagir avec le CP55, 940 sites de liaison (c.-à-THC site de liaison) du périphérique h CB 2 récepteurs cannabinoïdes avec un K i de valeur dans la gamme nanomolaire ( Fig 2. ) . Les résultats des études de modélisation moléculaire suggèrent que ( E )-BCP se lie à un ligand décrit précédemment poche de liaison putatifs dans l' h CB 2 récepteur ( Fig 3. ) ( 29 ). Bien que d'autres ligands comme N -alkylamides peut s'étaler sur l'ensemble du binding pocket amphiphatique ou lier à côté de la cavité accessible l'eau (par exemple, près de Y190) ( 29 ), ( E )-BCP se lie à la cavité hydrophobe, où il interagit avec les résidus hydrophobes F117, I198, W258, V113 et M265 ( Fig 3. ). La C5-double liaison C4 ( E ) BCP présente-à-π π empilement interaction avec F117 (4,0 Å), et donc sa géométrie joue probablement un rôle important pour h CB 2 de liaison au récepteur. Cette hypothèse est en accord avec la différence expérimental en CB 2 de liaison au récepteur entre ( E )-BCP et ( Z )-BCP ( Fig 2. ) et la perte d'affinité de liaison de l'oxyde de BCP ( Fig. S2 ). ( E -BCP activation) de l' h CB 2 récepteur déclenche un programme de stimulation complète, impliquant l'inhibition de l'AMPc, la stimulation de la [Ca 2 + ] i transitoires et faible activation des MAP kinases p38 et ERK1 / 2 ( Fig 4. et Fig. S4 ). Comme d'autres CB 2 -agonistes sélectifs du récepteur, ( E )-BCP conduit à des effets anti-inflammatoires in vitro et in vivo ( Fig 5. ). Une inhibition de la LPS-TNF-α stimulée et l'IL-1β expression ( Fig 5. A ) est généralement exercée par des ligands de récepteurs CB, telles que CB 2 agonistes des récepteurs ( 14 , 28 , 29 ). Cependant, le mécanisme sous-jacent moléculaire de cet effet reste à élucider. Nos données suggèrent que le CB 2 médiée par la suppression des récepteurs de ERK1 / 2 et JNK1 / 2 de signalisation est impliqué ( Fig. S6 ). Parce que ERK1 / 2 et JNK1 / 2 voies de signalisation sont essentiels pour LPS-expression stimulée de l'IL-1 et TNF-α ( 30 ), CB deux ligands de récepteurs capables d'inhiber l'activation de ces kinases peuvent réguler à la baisse de l'IL-1β et TNF l'expression de α. Les données ont montré ( 15 ) que les différents CB 2 -ligands sélectifs du récepteur, y compris CB 2 agonistes des récepteurs, sont capables d'inhiber la formation d'oedème carraghénane-stimulé chez la souris. Nos résultats sur le ( E -BCP-médiation inhibition) de carraghénane-oedème stimulé de type sauvage, mais pas (CNR2 - / - ) souris ( Fig 5. B ) sont en accord avec ces données. Assez paradoxalement, l'activation de la CB 2 récepteur a également été démontré que d'exercer des effets pro-inflammatoires dans la périphérie, comme dans la peau ( 31 , 32 ). Ainsi, différents types de cellules et le contexte de la stimulation semblent médier nettement différentes CB 2 dépendant du récepteur des effets immunomodulateurs. Ceci est également démontré par nos données, où ( E )-BCP dans les monocytes active constitutive ERK1 / 2 ( Fig. S4 ), mais inhibe la LPS-stimulé ERK1 / 2 ( Fig. S6 ). Que ce soit la dépendance inverse dose de ( E )-BCP et l'augmentation initiale de la formation d'oedème de type souris sauvages à 10 mg / kg de refléter l'action du différentiel actif sous-ensembles de protéines G doit être élucidé. Toutefois, dans le modèle carraghénane de l'inflammation aiguë, de faibles doses de ( E )-BCP sont clairement anti-inflammatoire ( Fig 5. B ). En outre, dans ce modèle, ( E )-BCP est plus puissant que la haute affinité CB 2 agoniste sélectif des récepteurs JWH133 ( Fig 5. C ). ( E )-BCP a été signalé à exercer divers effets anti-inflammatoires in vivo ( 33 , 34 ), y compris l'estomac et cytoprotecteur effets anti-inflammatoires. Ces résultats sont en accord avec la pharmacologie de la CB 2 agonistes des récepteurs ( 35 - 37 ). Dans un récent rapport ( 38 ), ( E )-α-BCP et humulène se sont avérés être des inhibiteurs par voie orale disponibles déclenchée par l'œdème et l'inflammation histamine chez des souris avec des effets équipotentes que la dexaméthasone. Bien que la base moléculaire de ces résultats n'a pas été élucidé à ce travail précédent, il ressort clairement de nos propres études qui α-humulène n'interagit pas avec la CB 2 récepteur ( Fig. S2 ). Ainsi, il est possible que l' in vivo les effets de sesquiterpènes macrocycliques ne peut pas être exclusivement médiée par le CB deux récepteurs, ce qui semble également être pris en charge par les expériences carraghénane avec 50 mg / kg par voie orale ( E )-BCP ( Fig 5. B ). Cependant, bien que encore inconnu d'autres cibles peuvent être impliqués, les effets anti-inflammatoires de l'oral de faibles doses de ( E )-BCP sont directement liés à la CB 2 l'activation du récepteur, parce que ( E )-BCP est inefficace (CNR2 - / - ) souris ( Fig 5. B ).
( E )-BCP est le premier Cannabis dérivés CB récepteur fonctionnel avec un ligand différents structure fondamentale de la cannabinoïdes classique. Ainsi, il représente un nouveau type de CB 2 -agoniste sélectif des récepteurs qui est basé sur une inhabituelle cyclobutane contenant échafaud. Récemment ( 39 ), un Cannabis extrait (Sativex) a été approuvé au Canada pour le traitement de la douleur neuropathique dans la sclérose en plaques. Parce que ( E )-BCP est un constituant majeur de cannabis huile essentielle ( Fig. S7 ) et montre des effets cannabimimétiques, il peut également contribuer à l'effet global de cannabis préparations, y compris le Sativex. En outre, ( E )-BCP est généralement ingérés avec de la nourriture végétale, et un apport quotidien estimé de 10-200 mg de ce sesquiterpène lipophile peut être un facteur alimentaire qui module potentiellement inflammatoires et d'autres processus physiopathologiques via le système endocannabinoïde. Par conséquent, la pharmacocinétique de la ( E )-PCA chez l'homme et son impact potentiel sur la santé doit être adressée dans les études futures.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Médicaments et d'anticorps.
Voir Matériaux SI et méthodes .
Analyse des données.
Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart type des valeurs ou ± SEM pour chaque groupe a examiné. La signification statistique des différences entre les groupes a été déterminée par l'étudiant t test (jumelé t test) avec GraphPad Prism4 logiciel. Outliner dans une série d'expériences identiques ont été déterminées par l'essai Grubb (ESD méthode) avec alpha fixé à 0,05. Les différences statistiques entre un véhicule de contrôle des groupes et des traités ont été déterminées par l'étudiant t test pour échantillons dépendants. Pour l'expérimentation animale, les différences statistiques entre un véhicule de contrôle des groupes et des traités ont été déterminées par des mesures répétées (ANOVA) et post hoc des tests de différence au carré. Les différences entre les échantillons analysés ont été considérées comme significatives à P ≤ 0,05. Une analyse de régression non linéaire (ajustement de la courbe) a été réalisée avec GraphPad Prism4 logiciel.
Cultures de cellules.
Voir Matériaux SI et méthodes .
Analyse par FACS de CB 2 Expression.
expression à la surface cellulaire de la CB 2 récepteurs a été quantifiée par immunofluorescence comme décrit dans la réf. 29 (pour plus de détails, voir SI Matériaux et méthodes ).
Expériences de déplacement de radioligands sur CB 1 et CB 2 récepteurs.
[ 3 H] CP-55, 940 et le déplacement des expériences de liaison ont été effectuées comme décrit dans la réf. 29 . (Pour plus de détails, voir SI Matériaux et méthodes .) Les données ont été installés dans une courbe sigmoïde et graphiquement linéarisé en projetant parcelles Hill, qui, pour les deux cas, ont permis le calcul de la CI 50 valeurs. Dérivé de la constante de dissociation ( K D ) de [ 3 H] CP-55, 940 (0,39 nM) et les tributaires de déplacement de concentration (IC 50 de valeur), constantes d'inhibition ( K i ) de composés concurrent ont été calculés en utilisant le Cheng-Prusoff l'équation [ K i = IC 50 / (1 + L / K D )] ( 40 ).
Modélisation Moléculaire.
Le CB 2 modèle homologie des récepteurs utilisés pour la modélisation moléculaire a été décrit dans la réf. 23 . Amarrage de ( E )-BCP, ( Z )-α-BCP et humulène et CB 2 -ligand complexes protéine MD / MM études ont été réalisées sur la base de protocoles d'accueil publié, en utilisant moléculaire et Sybyl7.3.3 paquets Tripos vigueur domaine de la modélisation Tripos ( 23 , 29 ). (Pour plus de détails, voir SI Matériaux et méthodes .)
Composition de l'AMPc.
L'homme CB 2 -receptorexpressing-K1 cellules CHO ont été étalées dans des plaques 96 puits à une densité de 3 × 10 5 cellules par ml et incubée pendant une nuit. Après aspiration de la presse, les cellules ont été réfrigérés pendant 10 min à température ambiante dans un milieu RPMI 1640 (w / o suppléments) contenant 500 uM 3-isobutyl-1-méthylxanthine. Les cellules ont ensuite été traitées avec différentes concentrations de composés test et incubées pendant 30 min à 37 ° C dans un volume total de 100 pi. Après encore 30 min d'incubation à 37 ° C avec 20 forskoline uM, les taux d'AMPc intracellulaire ont été détectés par HitHunter pour cellules adhérentes CEF test de détection en chimioluminescence (Amersham; pas. Catalogue 90000302) selon les instructions du fabricant du et mesurés sur une Microlumat Plus luminomètre pour microplaques LB 96V (EG & G Berthold). L'affinité des récepteurs CB haute ligand WIN55 ,212-2 a été utilisé comme contrôle positif.
Mesure de la [Ca 2 + ] i .
Intracellulaire de Ca 2 + a été quantifiée dans des lignées cellulaires HL60 par des mesures FACS comme décrit dans la réf. 29 . (Pour plus de détails, voir SI Matériaux et méthodes .)
Quantification de l'ABC des cytokines dans le plasma sanguin humain.
Périphérique humain cultures de sang total ont été obtenus comme décrit dans la réf. 29 . La production de cytokines dans le sang humain total périphérique a été analysée dans le plasma sanguin de sang total en culture pendant 18 h à 37 ° C, 5% de CO 2 , en utilisant Cytometric perle Arrays (BD Biosciences, l'homme inflammation ABC kit 551 811), comme décrit dans la réf. 29 . (Pour plus de détails, voir SI Matériaux et méthodes .)
Détermination de la p38, Erk1 / 2, et JNK1 / 2 d'activation.
Phsophorylation de p38 et Erk1 / 2 a été analysée en CB HL60 2 cellules positives et CD14 + des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). PBMC ont été isolées de l'homme couche leuco-plaquettaire par centrifugation en gradient de densité tel que rapporté dans la réf. 29 . Phosphoprotéine ont été quantifiés avec ABC Phospho p38 MAPK Flex Set 560 010 (T180/T182), Phospho Erk1 / 2 Flex Set 560 012 (T202/Y204), et le Phospho JNK1 / 2 Flex set (T183/Y185) de BD Biosciences selon le fabricant instructions.
Western blot.
Western blot ont été réalisées par des méthodes classiques (voir SI Matériaux et méthodes ).
Pour les animaux.
Homme CB 2 souris knock-out (CNR2 - / - ) sur un C57BL6 / J fond congéniques ( 32 ) et leurs C57BL6 / J (CNR2 + / + ) de type sauvage contrôles ≈ 3 mois d'âge ont été utilisés. Les animaux étaient logés en groupes de 3-5 et avaient accès à l'eau et nourriture ad libitum. Les conditions de logement ont été maintenus à 21 ± 1 ° C et 55 ± 10% d'humidité relative dans un cycle lumière-obscurité contrôlée (la lumière sur 7h00-19h00). Toutes les procédures expérimentales et de l'élevage ont été réalisées selon des principes directeurs éthiques.
Le traitement des animaux.
( E )-BCP a été dissous dans l'huile d'olive (Fluka) et gavés aux animaux (avec l'aide de l'alimentation aiguille) 30 min (50 mg / kg) et 60 min (5 et 10 mg / kg) avant le traitement carraghénane . L'huile d'olive sans ( E )-BCP a été gavés pour les animaux que le contrôle du véhicule.
Carraghénane-Paw œdème.
Les expériences ont été réalisées comme décrit dans la réf. 41 . En bref, carraghénane (2%, 20 mg / ml suspension dans une solution saline; Sigma) a été injecté intraplantaire dans un volume de 30 pi dans la patte arrière droite, en utilisant une aiguille de calibre 27. La patte gauche, a reçu la même quantité d'eau salée et il a été utilisé comme témoin. L'œdème a été mesurée en utilisant un compteur de volume (TSE) à un point dans le temps après injection de carragénine. L'œdème a été exprimée en millilitres par la différence entre le droit et la patte gauche.
Mesures GC.
mesures chromatographie en phase gazeuse ont été réalisées comme décrit dans la Pharmacopée européenne 5.5 (huile de Pinus silvestris) avec un électron Focus GC instrument Thermo (Thermo Fisher Scientific) muni d'une colonne de cire BGB (60 m, 0,25 mm de diamètre,-um film 0,25; n ° de série. 13651937). (Pour plus de détails, voir SI Matériaux et méthodes ).
MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE
Renseignements à l'appui
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REMERCIEMENTS.
Nous remercions le Dr. Irmgard Werner et Alex Hermann pour leur aide et l'assistance technique pour les mesures de GC, Andreas Nievergelt-Meier pour son aide avec les analyses de l'ABC, et le Dr Michael Detheux (Euroscreen SA, Bruxelles, Belgique) pour le CB 2 - K1 transfectées lignée cellulaire CHO-. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft FOR926 subventions et GRK804.
NOTES
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts.
Cet article est une présentation directe PNAS.
Cet article contient des informations à l'appui en ligne
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