Pour finir, si d'autres classes de stupéfiants sont utilisées dans ce post, elles le sont à but comparatif (point de vue chimique) et informatif; mais en n'aucun cas à but incitatif, c'est d'ailleurs pourquoi je ne parlerai quasi pas des effets (... je me vois mal décrire les effets du cannabis sur ce forum, les autres drogues, sur ce plan, n'étant pas le but de ce texte)
En outre, les normes, valeurs et seuils légaux peuvent varier d'un pays à un autre, les valeurs citées ici sont celles utilisées en Belgique.
Voila, comme ça, c'est dit.
Notes:
je rédige ce post en essayant à la fois d'être le plus complet et le plus clair possible. Je travaille depuis plus d'un an dans un centre d'expertises médico-légales (indépendant: je n'ai absolument rien à voir avec la police!) en tant que chimiste, je m'occupe de la recherche de toxiques sanguins (médicaments et stup') pour de multiples besoins (empoisonnements, accidents, viols, meutres, agressions...).
Répondant aux nombreuses questions posées par les assurances, familles de victimes, avocats, medecins mais également mes potes, je vais essayer d'expliquer la biochimie des stup' (ici, plus particulièrement le cannabis) et expliquer le pourquoi et le comment des méthodes employées pour leurs détections. Ce post va me servir de brouillon pour des notes que je dois rédiger, certaines simplifications (chimiques, biologiques) seront corrigées dans la versions "cours". Les valeurs utlisées pour illustrer les graphiques s'approchent de la réalité (en fonction des cas que j'ai rencontrés) mais ne sont pas issues d'un protocole scientifique, elles ne sont donc employées qu'à titre explicatif.
Je vais également créer une FAQ en fonction de mon expérience et par après, aux questions posées sur le forum.
Concernant la source d'informations, je me réfère à ma connaissance du sujet, seules les illustrations proviennent de sources extérieures. Afin d'éviter une bibliographie inutile (du mois, ici...), le lien vers la page contenant l'illustration sera placé (en dessous de l'illustration dans ce texte) et elles restent la propriété du site cité.
Je le redis une dernière fois, je ne dépends d'aucun service judiciaire...
C'est parti.
SOMMAIRE
1. biochimie du cannabis
.1.1 la détoxification
.1.2 l'élimination
.1.3 les milieux (sang, urine, cheveux et salive)
.1.4 les demi-vies (dans les différents milieux biologiques)
..1.4.1. le sang
..1.4.2. l'urine
..1.4.3. résumé de la durée de présence des métabolites du THC
..1.4.4. les cheveux
2. les méthodes de dosage
.2.1 introduction et définitions
.2.2 les méthodes immunologiques
..2.2.1. introduction
..2.2.2. l'emploi d'Ig dans un dosage
.2.3 les méthodes chromatographiques
..2.3.1. introduction
..2.3.2. l'extraction
..2.3.3. séparation
..2.3.4. détection
..2.3.5. résultats
.2.4. bilan des méthodes de dosage
..2.4.1. résumé de la technique immunologique
..2.4.2. résumé de la technique chromatographique
..2.4.3. avantages et inconvénients de la technique immunologique
..2.4.4. avantages et inconvénients de la technique chromatographique
1. Biochimie du cannabis
Pas de mystère, la molécule "star" du cannabis est le THC (ou Tétrahydrocannabinol).
Lien vers page
C'est le principe actif essentiellement retrouvé dans les plantes. On parle souvent de CBN et CBD, mais leur activité n'est pas encore 100% prouvée et leur très faible concentration feront que je ferai l'impasse à leur sujet.
Comme beaucoup de "toxiques" (au sens lage du terme), cette molécule, une fois ingérée (de quelque manière que ce soit) va subir 2 grandes étapes:
1. la détoxification,
2. l'élimination.
1.1 la détoxification
Cette étape a 2 fonctions: rendre inactif le thc et le préparer à être éliminé. On doit cette activité à un groupe d'enzymes hépatiques: les (pour être précis, monooxygénase à FADH de type) cytochromes P450 . Ils font toujours le même boulot (thc, médoc ou autres): ils inactivent les molécules par ajout de groupements -OH (très grosse simplification).
Donc, après consommation, on va voir apparaitre une molécule appelée...
THC-OH. Tout simplement.
Actuellement, le débat existe toujours quant à savoit si elle a une activitée ou non mais elle n'est présente qu'en très faible quantité car elle n'est qu'un intermédiaire: elle a une demi-vie très courte, elle suit la transformation du THC mais va directement (enfin, dans les quelques heures qui suivent) être transformée en THC-COOH.
Lien vers page
Le THC-COOH (la deuxième "star" de ce texte). Son petit nom: acide 11-nor-delta9-THC-carboxylique (vous comprendrez que je le résume).
Si vous cherchez "où ça se passe" sur le graphique ci-dessus, regardez au dessus à gauche des molécules. Les autres dérivés n'ont que très peu d'importance: ils ne sont jamais recherchés en "routine".
Donc j'en reviens à ma petite histoire, les cytochromes P450 ajoute au THC-OH un 2ème groupement -OH, transformant notre THC en sa forme acide, le THC-COOH. Ce métabolite n'a aucune propriété psychotrope (et, il me semble, aucune autre activité).
Les bases (bio)chimiques sont jetées, voyons donc le "pourquoi" de cette étape. Le THC est inactivé, d'où le nom "détoxification". Mais il faut également tenir compte d'un transformation importante: le THC-COOH est rendu plus polaire (porteur d'une charge négative au niveau du COOH), ce qui le rend nettement plus soluble dans le sang. Le problème des urines, c'est pour après.
1.2 l'élimination
Ce n'est pas pour autant que le THC-COOH peut être éliminé dans les urines. Le THC-COOH passe, au niveau rénal, dans l'ultrafiltrat mais est suffisamment "petit" pour être réassimilé de façon passive au niveau des "tubes" (proximal & distal). (à confirmer)
Bref, il sort par la porte mais rentre par la fenêtre.
L'organisme a trouvé la parade: il rend le THC-COOH plus "gros" en lui greffant un sucre: il est glucuroconjugué (toujours au niveau du foie) par la glucurotransferase.
Cette étape (l'élimination) est simple mais la glucuroconjugaison est une étape lente, ce qui va avoir son importance plus loin.
Il reste à parler des graisses... Pourquoi?
Le THC-COOH est une molécule de petite taille et qui garde, malgré son groupement acide, un comportement apolaire. Ce caractère lui permet de voyager dans toutes les cellules de l'organisme mais plus particulièrement: dans les adipocytes.
Kezaco? Ce sont des cellules spécialisées dans le stockage des graisses. Tout le monde en possède (ventre, cuisses mais également autour d'organes comme le coeur, les reins et glandes surrénales...). Les lipides (= graisses) étant par excellence des molécules apolaires, le THC-COOH, par affinité, va venir s'y loger. Et comme "qui se ressemble s'assemble", il va y rester "attaché".
Il est ensuite relargué de façon lente et continue dans le sang.
Question de logique: pourquoi le THC-COOH?
Les cytochromes P450 détoxifient rapidement le THC et THC-OH, les taux sanguins diminuent directement dès l'absoption. Si une de ces 2 molécules venait à se loger dans un adipocyte, par le phénomène d'osmose, il se retrouverait vite libérer dans la circulation sanguine.
Par contre, le THC-COOH subit un phénomène "d'embouteillage". En effet, il est rapidement produit mais il l'est beaucoup moins excrété (cfr. la détoxification). Il a donc le temps de s'accumuler dans les adipocytes.
1.3 Les milieux (sang, urine, cheveux et salive)
Résumé de l'épisode précédent.
- Dans le SANG: on retrouve du THC, THC-OH et THC-COOH.
- Dans les URINES: quasi exclusivement du THC-COOH glucuroconjugué
- Dans les CHEVEUX: un peu de THC et surtout du THC-COOH.
Pourquoi? Le cheveux est composé de cellules mortes qui s'accumulent. Quand la cellule meut, on peut considérer (grossièrement) que plus rien n'y entre et sort. Comme ce genre de cellules se divisent vite et meurt tout aussi rapidement, elles emprisonnent ce qui se trouvent dans le sang à ce moment précis.
- Dans la SALIVE: on peut extrapoler en pensant que le THC, THC-OH et THC-COOH passent par diffusion dans ce milieu (avec une préférence pour le THC-COOH car la salive est un milieu contenant des sels, d'où milieu polaire). (à confirmer)
Ne travaillant jamais sur ce milieu, je n'en sais pas plus.
1.4 Les demi-vies (dans les différents milieux biologiques)
Cette partie va en intéresser plus d'un car je vais aborder le sujet douloureux de la durée de présence des métabolites dans les milieux biologiques.
Par demi-vie, on entend le temps que met une concentration (d'un medoc, drogue...) à diminue de moitié. Après une demi-vie, il reste 50% de la concentration initiale, apres 2 demi-vies: 25%, 3: 12.5%...
On utilise ce terme car on estime souvent difficilement quand la molécule aura totalement disparu du sang (ou urine).
1.4.1. Le sang
Une demi-heure après un joint, on observe la concentration maximale plasmatique en THC (et THC-OH), elle est difficile à prévoir, car, en effet, elle dépend :
- - de la quantité d'herbe (ou de shit) utilisée
- de la qualité de l'herbe (elle-même fortement concentrée ou non en THC)
- de l'accoutumance de la personne
- du sexe
J'ai déjà vu des personnes atteignant 40µg/L mais je n'ai jamais les informations quant à la durée entre la dernière prise et le moment du prélèvement.
Ces concentrations diminuent assez rapidement (par rapport aux autres métabolites du THC) et il est souvent constaté qu'elles arrivent dans les 24h en dessous d'1µg/L.
Concentration plasmatique de THC & THC-OH en Y (en µg/L) sur le temps en X (en heure) (img. Orbital)
Le THC-COOH emprunte une voie plus ou moins similaire, seule la durée de demi-vie est différente (elle est plus longue).
Pourquoi? Revenons à l'élimination (cfr. 1.2). En fonction de la dose de THC absorbée et de la fréquence d'absorption (=du nombre de joints par jour), on va se retrouver avec une certaine concentration de de THC-COOH dans le sang. Comme ce THC-COOH est plus rapidement produit qu'il n'est éliminé, on peut en déceler dans le sang alors même que le taux de THC est inférieur à la détection.
Cela ce chiffre en jour, mais là encore, il varie selon les mêmes critères énoncés ci-dessus (quantité absorbée, acoutumance et sexe).
MAIS (il y a un "mais"). Lorsque le THC-COOH est présent dans le sang, il diffuse dans les adipocytes (cfr. 1.2). Or, plus il y en a dans le sang (à la fois en quantité mais aussi en durée), plus ces adypocytes vont absorber et stocker ce THC-COOH.
Par après, lorsque tout le THC-COOH sanguin a subit l'étape d'élimination, ces adipocytes vont relarguer à leur tour ce THC-COOH (stocké).
Donc, avec une méthode de dosage très sensible (cfr GC-MS), on peut continuer à doser une faible concentration en THC-COOH durant plusieurs jours.
Concentration plasmatique de THC-COOH en Y (en µg/L) sur le temps en X (en heure) (img. Orbital)
Sur ce graphique, on peut voir que la durée de présence du THC-COOH dans le sang est plus longue que celle du THC et THC-OH. La zone où la concentration en THC-COOH dépend du relargage des adipocytes devient rapidement très faible et devenir inférieure à la quantité détectée avec des méthodes très sensibles (symbolisé sur le graphique par des pointillés).
Mais ce n'est pas pour autant qu'on ne peut plus la déceler car il reste les urines.
1.4.2. L'urine
Comme vu précédemment lors de l'élimination (cfr 1.2), on ne retrouve dans les urines que du THC-COOH glucuroconjugué.
Dans un premier temps, l'enzyme responsable de la glucuroconjugaison est débordée: elle ne sait pas s'occuper de tout le THC-COOH présent dans le sang (s'en suit les conséquences énoncées ci-dessus).
Bref, les heures suivants la consommation de canna, on se retrouve avec un taux élevé et constant de THC-COOH glucuroconjugué dans les urines.
Par après, lorsque le THC-COOH présent dans le sang ne provient que de ce que les adipocytes relarguent, l'enzyme arrive à s'occuper de tout le THC-COOH présent dans le sang.
Conséquence: le taux de THC-COOH du sang va diminuer pour arriver en dessous de de ce que l'on peut détecter; il est toujours présent mais il est directement lié à un glucose (et donc éliminé dans les urines).
Pourquoi, dès lors, le cannabis se détecte plus longtemps dans les urines que dans le sang?
Parce que lorsque les adipocytes relarguent du THC-COOH dans le sang, c'est en très petite quantité (quelques µg/L). Ces molécules sont directement transformées en THC-COOH glucuroconjugué et passent dans les urines où elles s'accumulent, d'où une concentration urinaire TOUJOURS plus élevée que la sanguine.
Concentration urniaire de THC-COOH glucuroconjugué en X (en µg/L) sur le temps en Y (en heure) (img. Orbital)
1.4.3. Résumé de la durée de présence des métabolites du THC
Ce résumé s'applique à une seule prise (= 1 joint)
Sang:
- THC & THC-OH: quelques heures, 24h. Durant cette période, même si la personne n'est plus sous influence, il peut rester quelques µg/L dosables
- THC-COOH: plusieurs jours, difficile à estimer car est soumis à plusieurs variables (sexe, qualité de l'herbe, masse graisseuse...)
Urine:
-THC-COOH (glucuroconjugué): on peut considerer l'équivalent d'une semaine pour voir sa concentration devenir inférieure à celle détectable.
Tout comme dans le sang, sa concentration et sa durée de détection va varier selon les mêmes facteurs. De par sa fonction d'élimination, le rein va concentrer dans l'urine le THC-COOH glucu., un taux sanguin très bas (voire indécelable) va passer à taux urinaire facilement quantifiable.
Je prends souvent cette image pour expliquer ce phénomène:
le camion poubelle, des rues remplies d'immondices et la décharge. Ne rigolez pas!
Les rues = la circulation sanguine
Les éboueurs = l'enzyme responsable de la glucuroconjugaison
La decharge = l'urine
Lors de la consommation, les rues se chargent d'immondices (le sang de THC-COOH), les éboueurs sont débordés de travail (l'enzyme est saturée). Durant tout un temps, ils vont nettoyer les rues mais on continuera à y appercevoir les poubelles (le THC-COOH est décelable dans le sang). A partir d'un moment, ils auront quasi tout nettoyer, les rues ont l'air débarrassées des immondices mais ils continueront à trouver et ramener des dechets à la décharge où ils s'y accumulent (le "rare" THC-COOH sanguin n'est plus "visible" mais comme accumulé dans l'urine, continue à y être dosable).
1.4.4. Les cheveux
Le dosage sur le cheveux n'est pas fréquent. Il est le témoin de ce qui a circulé dans le sang au moment où la cellule du follicule pilleux s'est divisée et accumulée pour former le cheveux. Par estimation, en fonction de la longueur du cheveux où est retrouvé le THC et THC-COOH, on peut grosso modo évaluer la période de consommation d'une personne.
Il faut bien se rendre compte qu'il faut une consommation régulière durant un certain laps de temps pour arriver à "contaminer" suffisamment de cellules pour le détecter, si bien que cette méthode n'est réservée qu'à quelques rares cas d'expertises.
Info: vitesse moyenne de pousse du cheveux: +/- 1cm/mois.
2. Les méthodes de dosage
Il existe 2 grandes méthodes de dosage (pour la quantification des métabolites du cannabis): les méthodes immunologiques et celles par chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse. Je vais vous expliquer leurs fonctionnements et leurs applications.
2.1 Introduction et définitions
Le cannabis est un bonheur pour les dosages et un malheur pour ses consommateurs. Hormis le fait que l'organisme le stocke longtemps pour le relarguer au fur et à mesure, le THC et ses métabolites sont des molécules stables, ne nécéssitant pas de précautions particulières pour sa conservation (du moins, la conservation de la matrice -sang & urine- se fait selon les règles habituelles) et ne possède pas de composés sécrétés dans l'organisme ayant une structure chimique similaire.
Définitions... Non je ne vais pas vous abreuver de définitions sorties d'un dictionnaire mais je dois néanmois vous définir clairement certains termes que je vais employer.
Spécificité: la spécificité d'une méthode de dosage est sa capacité de doser un seul composé et non pas un "ensemble" de composés (pouvant d'ailleurs être complètement différents).
Un exemple: un panier de fruit. Une méthode peu spécifique vous permettra de dénomber le nombre d'agrumes alors qu'une méthode très spécifique vous permettra de dénombrer uniquement les oranges, sans tenir compte des pamplemousses. Une méthode encore plus sensible vous permettra de dénombrer des oranges à jus d'oranges à éplucher.
Sensibilité: la sensibilité d'une méthode de dosage est sa capacité à doser une quantité très faible de molécules.
Un exemple toujours fruité: une méthode peu sensible vous permettra de dénombrer le nombre de caisses de fruits; une méthode sensible, le nombre de raviers de myrtilles dans une caisse; une méthode très sensible: le nombre de myrtilles par ravier.
Ces 2 paramètres sont primordiaux dans la détermination d'un résultat, d'une part pour être certain que le résultat positif ou négatif l'est réellement (=> spécifique) et que sa quantification soit le plus juste possible (spécifique et sensible).
D'autres paramètres entre en compte, l'exactitude, la justesse, la répétabilité et la reproductibilité mais je fais le choix de ne pas les évoquer (il me semble moins important pour expliquer à un large public les techniques de dosages). Si, néanmois, quelqu'un désire que je développe un peu plus l'un de ces termes, qu'il le mentionne.
2.2 Les méthodes immunologiques
Les "méthodes immunologiques" est un terme englobant plusieurs méthodes à proprement parler (MEIA, FPIA, ELISA...) ayant toutes en commun l'emploi d'anticorps.
Ces techniques sont le plus souvent automatisées.
(Exemple d'automate) | Lien vers page
2.2.1. Introduction
Un anticorps... Oui oui, on parle bien d'anticorps (je préfère le terme immunoglobuline, abrégé par Ig), ceux-là même que l'on retrouve chez un individu sain. Pour la petite histoire, il constitue une barrière de défense de l'organisme, appelée... immunologique (CQFD).
Bref, par nature, une Ig est une protéine ayant comme fonction la reconnaissance de molécule (son antigène).
Lien vers page
Schéma classique de l'Ig; pour faire simple, on retrouve systématiquement une partie commune pour toutes les Ig (chaine lourde, zone charnière et chaine légère), seule varie la "zone de variable" (forcément...).
A quoi sert cette zone? Elle varie en fonction de la molécule qu'elle doit reconnaître, d'où une très grande spécificité. Lorsque l'Ig reconnait sa "molécule cible", elle s'y fixe.
Mon but n'étant pas de donner un cours d'immunologie pure, je m'arrêterai là quant à la description sommaire (et incomplète) d'une IG, l'important est de cerner sa capacité à reconnaître une molécule.
2.2.2. L'emploi d'Ig dans un dosage
Les groupes pharmaceutiques proposent maintenant la production Ig capables de reconnaitre un vaste pannel de molécules différentes (enfin, 1 Ig pour 1 molécule, ce qui nécéssite la production d'Ig différents en fonction de la molécule cible).
La technique décrite ci-dessous est du type FPIA (fluorescence polarizing immunoassay), de nombreuses variantes existent mais c'est une des plus simple dans son fonctionnement... et c'est celle que j'utilise.
Dans notre dosage, cet Ig est capable de reconnaitre le THC-COOH glucuroconjugué. En effet, la molécule cible doit posséder une taille "minimum" pour être reconnue, seul ce métabolite du THC le permet. D'où l'obligation d'utiliser de l'urine pour le dosage (cfr 1.2)
Cet Ig est fixé à la paroi d'un puit de réaction =>
Pour effectuer le dosage, rien de plus simple: l'urine du patient est mélangée avec un réactif contenant du THC-COOH glucuroconjugué marqué à la fluorescéine.
La fluorescéine a comme particularité de devenir fluorescente lorsque l'on "l'illumine" avec des rayons ultraviolets (@530nm).
On laisse incuber quelques minutes puis on rince le puit, ce qui permet d'enlever l'excedent de THC-COOH glucu. qui ne se serait pas lié aux Ig du puit ainsi que d'autres substances contenues dans l'urines pouvant interférer lors du dosage.
THC-COOH glucu. contenu dans l'urine du patient
THC-COOH glucu. marqué à la fluorescéine. La fluorescence sera indiquée par un halo vert.2 cas de figure:
A. le patient n'a pas de THC-COOH glucu. dans ses urines, seul le THC-COOH glucu. marqué à la fluorescéine se fixe dans le puit.
Lorsque le puit est bombardé de rayons uv (par le dessus), la fluorescéine emet un rayon fluorescent qui peut être mesuré (sur le coté).
La quantité de fluorescéine contenue dans le puit est directement proportionnelle à la quantité de THC-COOH glucu. liés aux parois du puit.
Plus elle est présente, plus la lumière fluorescente émise sera forte.
(img. Orbital)
B. le patient a du THC-COOH dans ses urines. Plus il en a, plus celui-ci va se lier au Ig de la paroi du puit.
Après le lavage, il ne restera que peu de THC-COOH glucu marqué à la fluorescéine. Or peu de fluorescéine, peu de lumière fluorescente.
(img. Orbital)
Pour quantifier le THC-COOH contenu dans l'urine du patient, il suffit de mesurer la lumière fluorescente émise: plus elle est forte, moins le patient est positif.
Le détecteur n'est pas placé dans le champs de la lumière incidente (c'est à dire, selon la trajectoire décrite par la fleche "uv" sur le graphe) afin d'éviter une lumière parasite. La lumière "latérale" est en effet uniquement produite par la réaction de fluorescence de la fluorcescéine, d'où le placement du détecteur sur le coté.
C'est bien beau tout ça, mais comment "voir" une différence de fluorescence et comment savoir à combien de µg de THC-COOH glucu. elle se rapporte.
Cette technique est entièrement automatisée, on place simplement l'urine dans un godet, on sélectionne le type d'analyse et c'est parti.
Pour quantifier, les firmes pharma fournissent des solutions de THC-COOH glucu. à des concentrations connues.
Par exemple, on place 6 puits de réaction.
Dans le 1er => il y a 20ng/L
Dans le 2eme => 30ng/L
Dans le 3eme => 50ng/L
...
La machine mesure la lumière fluorescente émise en fonction de la concentration et réalise une droite de calibration.
(img. Orbital)
Ensuite, lors du dosage d'un patient, l'intensité de la fluorescence mesurée est reportée sur la droite, ce qui permet la quantification.
Je vais développer la seconde méthode de dosage puis je résumerai les 2, en comparant leurs qualités et défauts.
2.3 Les méthodes chromatographiques
Ne cherchez plus, c'est la méthode de dosage ultime. Il en existe différentes variantes: chromato liquide (LC), en phase critique,... mais celle utilisée pour une grande partie des stupéfiants est du type chromato gazeuse (GC).
Mais il ne s'agit là que d'une partie de l'appareillage. En effet, la chromatographie n'a pour but que de séparer différents éléments.
Il nécéssite donc un détecteur; il en existe également de différentes sortes, basés sur des propriétés spectrales (DAD), "combustibles" (FID)...
Pour les drogues, un seul, le plus puissant: le spectromètre de masse (MS).
D'où, la GC-MS.
2.3.1. Introduction
Comme décrit ci-dessus, une GC-MS est composée de 2 appareils, ayant chacun un role particulier: séparer les composants d'une solution et les analyser. Cependant, une étape préliminaire est réalisée: une extraction.
En effet, injecter directement de l'urine ou du sang dans la machine reviendrait à la boucher ou la foutre en l'air. Quant à des analyses sur d'autres matrices (cheveux, comprimés...), ce serait impossible.
(un exemple de GC-MS) | Lien vers page
2.3.2. L'extraction
Le but de l'extraction est d'isoler une molécule (ou un groupe de molécules) d'une matrice (sang, urine, cheveux...). Pour cela, il faut connaitre certaines propriétés physico-chimiques des molécules que l'on recherche.
Je vais brièvement décrire les étapes nécessaires pour extraire les métabolites du THC.
Si on part de l'urine, il faut enlever le sucre greffé au THC-COOH. La méthode classique est de passer en pH basique à "haute température" (60-70°c cela suffit, 30-60 minutes).
Ensuite, on obtient du THC-COOH libre.
A partir de ce moment, que ce soit du sang ou de l'urine, les étapes sont les mêmes.
On part généralement d'un volume d'échantillon de 1 à 5ml d'urine (en fonction du labo et de la technique), un à 2 ml de sang suffisent.
On "met à pH", en gros, on ajoute une solution à un certain pH afin que les molécules que l'on veut extraire ne soit pas chargées (c'est un peu technique...).
On mélange à une grande quantité de solvant organique (cfr. 1.4.1, molécule apolaire...), tous les métabolites du THC vont venir s'y concentrer. On se retrouve avec 2 phases dans le tube:
- une inférieure, contenant le sang ou urine ainsi qu'une grande partie de composés ininterressants
- une supérieure, organique, où toutes les molécules non chargées sont venues se loger (d'où la mise à pH).
Lien vers page
Ensuite, on transvase la phase supérieure (sur la photo, la claire) dans un nouveau tube et on la fait évaporer. Tous les composés vont être sous forme de résidus secs au fond de ce tube.
On dérive ou non (le but est de modifier les molécules à doser afin de les rendre "utilisables" sur GC-MS) (si on dérive, on refait évaporer).
On reprend ces résidus secs avec un nouveau solvant injectable sur GC-MS (l'octane fonctionne à merveille) et on met en vials.
(Différents vials) | Lien vers page
2.3.3. Séparation
Voyons d'abord le schéma général d'une GC-MS
Lien vers page
La séparation a lieu dans la partie "Gas Chromatograph". Il s'agit d'un four, dans lequel est placé une colonne. Pas une colonne greco-romaine...
Imaginez un tuyau d'arrosage, enroulé sur lui-même, en alliage métallique, de 30m de long et 0,25mm de diamètre (oui oui, 1/4 de millimetre) (pour une colonne "classique"). A l'intérieur de celle-ci, on retrouve des chaines d'atomes de carbone lié à la paroi.
Dans cette colonne passe en permanence un gaz, de l'azote ou de l'hélium.
(un exemple de colonne) | Lien vers page
Le tout est piloté par ordinateur, le procédé est exactement le même pour tous les échantillons.
L'échantillon, contenu dans le vial suite à l'extration, est injecté dans la colonne. Le four est froid, l'échantillon liquide vient se coller dans les atomes de carbone lié à l'intérieur de la paroi de la colonne. Plus le four monte en température, plus des composés vont passer de l'état liquide à l'état gazeux. Chaque composé passe à l'état volatil à une témpératue qui lui est propre, ce qui permet de séparer de nombreuses molécules dans la solution injectée.
Lorsqu'un composé passe dans son état gazeux, il est emporté par le gaz passant en permanence dans la colonne. Cette dernière étant branchée sur le détecteur (le MS) vous vous doutez où arrivent les composés...
Comme le four monte pregressivement en température, toutes les molécules arrivent à un moment différent au détecteur. Et comme ce four monte toujours en température de la même façon, on sait quand sort le composé qui nous interresse.
Mais comment savoir quand ce composé va sortir?
Les firmes pharmaceutiques proposent des solutions ne contenant qu'un composé pur. Il suffit de l'extraire comme lors de la première étape, de l'injecter dans la colonne et de connaitre, grace aux detecteur, son temps de rétention dans la colonne.
Cette méthode permet de séparer des molécules dont la masse varie... d'une unité atomique (à un hydrogène près... donc pas de problème pour les 3 métabolites du cannabis).
2.3.4. Détection
Pour analyser ce qui est séparé par la GC, rien de plus puissant qu'un spectromètre de masse. Sur le schéma du paragraphe précédent, il s'agit de la partie B, C & D.
Il en existe de différents types: quadripole, temps de vol, trappe à ions...
Il fonctionne tous selon le même principe de base mais varie de la manière d'isoler les ions.
Le principe? Les molécules sortent de la colonne après un certain temps (rétention), elles arrivent au niveau de la source (B).
Cette source n'est autre qu'un filament, tel celui que l'on retrouve dans une ampoule électrique. Ce filament est chauffé par le passage d'un courant électrique très intence, tellement qu'une grande quantité d'électrons finit par être ejectée.
Ces électrons entrent en collison avec les molécules sortant de la colonne.
Lorsqu'un excès d'électrons est "contenu" (simplification +/- correcte) par une molécule, elle se fragmente. Si le nombre d'électrons que reçoit cette molécule est toujours identique, elle se casse en donnant plusieurs fagments ayant toujours des masses identiques.
(cette masse est la somme des masses des atômes qui compose la molécule. Par exemple, le carbone a une masse de 12, l'oxygène 16, l'hydrogène 1. Un C3 O2 H6 aura une masse de 3x12 + 2x16 + 6x1 = 74).
Un exemple? Le THC (ici, dérivé, pour info...) va produire majoritairement 3 ions de masse: 371, 313 et 289.
Un autre composé n'ayant pas la même structure va produire des fragments différents. Même deux isomères (2 molécules ayant des atômes identiques en même quantité mais possédant une structure spaciale différente) donneront un résultat différents permettant de les reconnaitre.
Donc, toutes les molécules vont produire des fragments différents, ces fragments étant directement liés à la structure de la molécule initiale.
Pour un homme, cela équivaudrait à connaître son emprunte génétique.
On possède les fragments, restent à analyser. Les molécules sortant de la colonne ne porte pas de charge, ses fragments bien. Cette propriété va être mise à contribution.
Tout comme un morceau de fer et un aimant, un fragment chargé va être attiré par sa "charge contraire" (le moins par le plus et vice-versa), un système de lentilles electriques va les canaliser vers l'analyser (C).
C'est ici que l'on rencontre les diffences entre spectromètre de masse.
Un quadripole va être constituté de 4 barres métalliques sur lequelles on applique des courants électriques continus & alternatifs, ce qui va attiré +/- les fragments en fonction de leur poids et charge.
Une trappe à ion va faire tourner les fragments entre 3 parties métalliques, le "diametre" du cercle qu'ils décrivent est fonction de leur masse et charge.
Le temps de vol analyse le temps que les fragments mettent pour parcourir une certaine distance (toujours en fonction de...).
Donc, d'une multitude de fragments (en fonction des molécules arrivant de la colonne), on peut en isoler certains, spécifiques de la molécule à analyser.
Pour info, ces fragments arrivent sur un dispositif de type "électomultiplicateur" (D), où ils sont "transformés" en courant electrique, son intensité etant direment lié au nombre de fragments.
2.3.5. Résultats
Comment interpreter un résultat? Ce qu'il faut retenir du point précédent, c'est que la molécule, un fois "cassée", va produire toujours les mêmes fragments. Afin d'éviter tout hasard possible, on ne va pas mesurer 1 mais plusieurs fragments en même temps. En effet, au niveau probabilité, il peut arriver que 2 molécules totalement distingues donnent 1 fragment de même masse (alors que leur structure dans l'espace est différente);
1 c'est possible, pas 3 si vous avez un doute, relisez la partie ci-dessus au niveau de la production de fragments).
Voici un chromatogramme
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Il ne s'agit pas d'un chromatogramme du THC mais le principe est le même. En abscisse, toujours le temps (T zéro correspond à l'injection de l'echantillon dans la colonne); en ordonnée, l'abondance du pic (que l'on peut comparer à la concentration).
Petit jeu: s'il s'agissait du THC à analyser... où serait-il sur le graphique?
... entre 25 et 55 minutes? Non. Chaque couleur montre la présence et l'abondance d'un fragment, pour être certain que la molécule que l'on recherche est présente, il faut la présence d'un pic pour les 3 fragments au même temps, ici, à 10 minutes (pour les septiques, suivez le graphe vert...).
Il faut également vérifier que le temps de rétention de la colonne est bien de 10 minutes avec le passage d'un échantillon positif.
Pour la quantification, idem que pour la technique précédente: on compare le pic obtenu par rapport à des échantillons préparés au labo, dont on connait la concentration (et dont on reporte les valeurs sur un graphique).
2.4. Bilan des méthodes de dosage
Bravo à ceux qui ont réussi à gober la tartine ci-dessus.
Je vais d'abort dresser un récapitulatif des 2 techniques décrites ci-dessus puis je vais énoncer leurs avantages et leurs inconvénients.
2.4.1. résumé de la technique immunologique
Comme vous avez pu le lire, cette méthode repose sur la reconnaissance du THC (du moins, le THC-COOH glucuroconjugué) par un anticorps spécifique: lorsqu'il reconnait sa molécule "cible", celle-ci vient s'y fixer.
Pour compter le nombre d'anticorps ayant "capturé" une molécule de THC-COOH glucu., on procède à l'envers en comptant les anticorps libres.
2.4.2. résumé de la technique chromatographique
Les échantillons sont d'abord traités chimiquement pour extraire le composé à analyser (extraction). Cet extrait est ensuite injecté sur une GC-MS.
La partie GC (chromato gazeuse) permet de séparer tous les constituants injectés et de les envoyer 1 par 1 au détecteur.
La partie MS (spectrometre de masse) va casser les molécules puis les collecter et analyser leur masse (~ leur poids).
Chaque molécule donnant des fragments lui étant propres, il suffit d'en monitorer 3 spécifiques pour être certain de la présence ou non du composé dans l'échantillon.
2.4.3. avantages et inconvénients de la technique immunologique
SPECIFICITE: La reconaissance par anticorps fonctionne bien. Mais il arrive parfois (c'est très rare, <1% de probabilité) qu'une molécule totallement différente de celle à doser présente une petite partie similaire (avec la molécule cible) pour qu'il y ait reconnaissance et liaison. Néanmoins, des molécules donnant de faux positifs sont... les autres métabolites du THC (confirmé par la notice fournie dans le kit de réaction).
De plus, cette technique n'est pas assez spécifique que pour quantifier chaque métabolites du THC séparément.
SENSIBILITE: Pas mal. Avec un kit de réactifs "spécial THC urinaire", on descend entre 10 et 20 µg/L (d'urine).
Pourquoi pas plus bas? Comme vous avez pu le lire (cfr. 2.2.2. L'emploi d'Ig dans un dosage ), on utilise l'intensité de la fluorescence pour déterminer la présence ou non de THC-COOH glucu. Or, que le patient ait quelques molécules de THC-COOH glucu. qui se fixent ou non (lorsqu'il est très faiblement positif), l'intensité de la fluorescence sera quasi identique, si bien que la machine ne peut affirmer la précence ou non. La plus petite différence d'intensité identifiable avec certitude se marque autour de 10µg/L.
Pour le sang, il s'agit d'une limite trop haute.
DUREE DE L'ANALYSE: l'urine pouvant être directement utilisée, c'est très rapide. Entre 10 et 20 minutes par échantillon.
USAGE: dans un labo de routine, cela permet de trier les échantillons à confirmer par GC-MS ou non: en effet, vu le risque possible d'échantillons faussement positifs, tout résultat (positif) doit être confirmé par GC-MS.
En cas d'intoxication, cela permet de donner une réponse rapide au clinicien.
CONCLUSION: l'analyse immunologique permet de rendre un résultat rapide et fiable. Cependant, son application limitée à l'urine et le très faible risque de faux positif la destine à un usage de dépistage.
Le résultat doit être intepreter avec précaution, un taux fort élevé de THC-COOH glucuroconjugué pouvant provenir d'une consommation récente (<24h) ou d'un consommateur régulier.
2.4.4. avantages et inconvénients de la technique chromatographique
SPECIFICITE: elle est maximale. En effet, l'extraction "trie" les molécules que l'on veut injecter dans la GC-MS; la GC sépare les molécules "triées" précédemment, et les envoie une à une à la MS, toujours dans le même ordre et après le même laps de temps passé dans la colonne. La MS casse les molécules toujours en les mêmes fragments, si bien que si on les retrouve, c'est que la molécule à doser était présente dans l'échantillon de base.
Faux-positif? Impossible car on a accès à la structure chimique même de la molécule; cela permet même de quantifier chaque métabolite de façon spérarée (THC,THC-OH & -COOH dans le même échantillon).
Ce qui permet de traiter des échantillons de nature différente (urine, sang, cheveux, liquide divers...).
SENSIBILITE: c'est la technique qui permet de rendre les résultats les plus faibles de façon fiable. C'est d'ailleurs celle employée pour les dosages sanguins. On arrive facilement à déceler avec certitude des concentrations d' 1µg/L.
DUREE DE L'ANALYSE: son point faible. L'échantillon doit être obligatoirement extrait. Il faut compter quelques heures pour cette étape. Quant à sa durée "sur la machine", il faut bien compter 25 minutes par échantillon (c'est fonction de la manière dont la GC-MS est programmée).
USAGE: confirmation de tout résultat positif obtenu avec une technique immunologique. Elle est d'ailleurs directement utilisée pour des recherches spécifiques (par exemple: une demande d'un medecin de détection de stupéfiants chez un patient) ou pour des résultats judiciaires.
CONCLUSION: l'analyse chromatographique est la méthode la plus spécifique et la plus sensible. Elle est d'ailleurs employée pour confirmer tout résultat rendu.
L'extraction la rend "tout terrain" (sang, urine, cheveux...) si bien qu'elle peut s'étendre à de nombreuses recherches.
Seule sa préparation (durée de l'extraction) et la lecture du résultat (cela demande une certaine expérience) lui font perdre des points dans la quète de "l'analyse parfaite".
), une prise de sang est réalisée (par une personne habilitée, un medecin ou un infirmier). En effet, c'est le seul moyen de vérifier si la personner est toujours sous l'effet du THC (cfr 1.1).
